【干货】一文了解vero细胞培养全流程

Vero细胞系是连续非整倍体细胞，连续细胞系可以经过多次分裂而不衰老，非整倍体是指细胞中的染色体数目与通常的不同。与其它普通哺乳动物细胞不同，Vero细胞还有干扰素分泌缺陷的特点，当被病毒感染时，它不能分泌干扰素，但它仍然具有α/β-干扰素的受体，所以对于其它来源的干扰素仍有正常的反应。

一、基本信息

细胞名称：Vero非洲绿猴肾细胞

细胞别称：VERO; Verda reno

细胞形态：上皮细胞样

生长特性：贴壁生长

组织来源：正常肾

培养基：MEM+10%FBS+1%PS

生长条件：

①气相：95%空气+5%二氧化碳；

②温度：37℃

传代方法：1:2至1:3，每周2-3次。

二、培养指南

1. Vero细胞复苏步骤

(1)将1mL Vero细胞悬液冻存管于37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基进行混合均匀；

(2)在1000rpm条件下离心4min，弃上清液，再加入1-2mL培养基后轻轻吹打混匀；

(3)将Vero细胞悬液加入到含有适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入到6cm皿中，加入约4mL的培养基，培养过夜）；

(4)第二天换液并观察Vero细胞密度。

2. Vero细胞传代步骤

Vero细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

(1)1mL Vero猴肾细胞悬液冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀；

(2)在1000rpm条件下离心4min，弃上清液，再加入1-2mL培养基后吹打混匀；

(3)将Vero猴肾细胞胞悬液加入到含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入到6cm皿中，加入约4mL培养基，培养过夜）；

(4)第二天换液并观察Vero细胞密度。

3. Vero细胞冻存步骤

Vero细胞生长状态良好，可进行细胞冻存。以T25瓶为例：

(1)收集Vero细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，于1000rpm条件下离心4min，弃上清液，用PBS清洗一遍，弃掉PBS后进行细胞计数。

(2)根据Vero细胞数量对应加入无血清细胞冻存液，使细胞密度在5×106~1×107/mL之间，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管上做好标识。

(3)将冻存管放入-80℃冰箱中，24h后转入液氮灌储存。

三、注意事项

1. 培养基不能回收使用

灌液培养基不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。

2. 细胞到货处理说明

(1)收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象。

(2)观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置2-4h。

(3)收到Vero细胞后第一次传代建议1:2传代，1:2传代是指1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿，而不是1个T25瓶传2个10cm皿。

四、常见问题

1. vero细胞培养出现小黑点？

处理方法：在细胞消化离心弃上清后，使用PBS重悬洗涤，在750rpm条件下低速离心4min，重新铺下，然后镜下观察是否干净。

2. vero细胞生长过慢？

(1)更换不同培养基或血清导致

解决方法：分析新培养基与原培养基的成分，比较新血清与原血清支持细胞生长实验，让细胞逐渐适应新培养基。

(2)有少量细菌或真菌污染

解决方法：用含抗生素培养液培养，如发现污染，尽量丢弃培养物。

(3)试剂保存不当导致

解决方法：血清需要保存在-10到-20℃；

培养基需在2-8℃避光保存；

含血清完全培养液在2-8℃保存。

(4)接种细胞起始浓度太低

解决方法：增加接种细胞起始浓度。

(5)细胞已老化

解决方法：引入新的保种细胞，重新培养。

(6)支原体污染

解决方法：吸取部分培养基，离心得上清，检测支原体；

清洁支架和培养箱；

可在培养皿里加入支原体去除剂清除；

如发现支原体污染，建议尽量丢弃。

3. vero细胞培养过程中不贴壁？

(1)胰酶消化过度导致

解决方法：尝试缩短胰酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。

(2)支原体污染

解决方法：吸取培养2-3的培养基，检测支原体；

清洁支架和培养箱；

 如发现支原体污染，丢弃培养物。

(3)培养基pH值过碱（NaHCO3分解）

解决方法：使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2。

(4)细胞老化

解决方法：购买新的代数较低的细胞。

(5)接种细胞起始浓度太低或太高

解决方法：调节最佳接种细胞浓度。

4. vero细胞用什么培养基？

vero细胞培养基：MEM+10%FBS+1%P/S

5. vero细胞DMSO冻存比例？

冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配或无血清细胞冻存液。

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